меню

Культуры клеток являются неотъемлемой частью разнообразных лабораторных исследований. Выращивание стерильных культур клеток животных началось около 100 лет назад, однако клетки растений довольно долгое время никак не поддавались содержанию на питательных средах в лабораториях. Были выделены многие метаболиты растений, частично исследованы механизмы роста, в среду для культивирования добавляли ауксины... Не помогали и разнообразные экстракты дрожжей и растений, а также выделенная из молок сельди ДНК. Клетки в культуре лишь вяло делились и чаще всего скоро прекращали развитие. Однако в ходе наблюдений выяснилось, что кокосовое молоко и флоэмные экссудаты могут стимулировать деление клеток. Таким образом, было очевидно, что существует некое вещество, ответственное за пролиферацию клеток.

Ни для кого не секрет, что многие открытия происходят по чистой случайности или даже из-за неосторожности и несоблюдения методики. Так получилось и в этом случае. Перед посадкой культуры помещенную в автоклав среду перегрели, и внезапно именно на этой среде культура стала нормально расти, а клетки - делиться. Было выделено вещество, индуцирующее деление: им оказался 6-фурфуриладенин, названный кинетином (от слова «деление»). Как выяснилось, при нагревании и разрушении ДНК часть аденинов отсоединяется от сахарного остатка и претерпевает пренилирование по шестому положению. Действующее вещество было выделено Миллером в 1955 году. Таким образом, кинетин – это искусственный цитокинин, являющийся, в отличие от природных аналогов, термостабильным.

Первый природный цитокинин – зеатин - вскоре был выделен из эндосперма кукурузы (Zеа) в 1961 году.

Важнейшие из цитокининов, которые встречаются в растениях в свободном виде – N6-изопентениладенин (IPA) и транс-зеатин (tZ) (рис.1).

Природные цитокинины также являются производными аденина. В ходе синтеза к азотистому основанию рибонуклеотида (АМФ) цитокинин-синтаза (изопентенилтрансфераза) присоединяет изопентенильную группу в 6-ом положении, а далее происходит дефосфорилирование с последующем отщеплением рибозы (рис.2).

Интересно, что цис-зеатин и изопентениладенин могут входить в состав тРНК, но, по-видимому, «образования» гормона при ее распаде не происходит.

Цитокинины в клетке могут быть инактивированы путем коньюгации с сахарами или путем окисления с удалением пренилового остатка.

Биосинтез цитокининов происходит в основном в апикальной меристеме корня, но также может протекать в листьях, семенах, плодах и элементах флоэмы. Концентрация гормона в основном убывает по мере удаления от места синтеза.

Рецепторы цитокининов (например, белок CRE 1) расположены на клеточной мембране, причем наружный фрагмент связывается с цитокинином, а внутренний, находящийся в цитозоле, обладает киназной активностью (типичные димерные гистидинкиназы). Связывание гормона индуцирует фосфорилирование рецептора по остатку гистидина. Предполагается, что рецептор взаимодействует с МАР-киназной системой (mitogen-activated protein). МАР-киназные пути в клетках приводят к изменению программы развития, активируя разнообразные факторы транскрипции, то есть влияя на реализацию генетической информации и клеточный цикл. Многие механизмы этих путей остаются плохо изученными.

В отличие от ауксинов, для цитокининов не существует полярного транспорта: они http://jackiebravo.com/term/sitemap21.html переносятся пассивно и   купить Герман Льгов неполярно по растению снизу вверх по ксилеме (рис.4).

Как и ауксины, цитокинины вызывают множество физиологических эффектов.

  1. follow site Аттрагируюций эффект. Как и апекс побега, апекс корня нуждается в питательных веществах.

Если провести эксперимент (рис.5), в ходе которого на отделенные от растения листья будут наносить питательные вещества (меченный глицин 14С) и цитокинин (кинетин), то можно выявить ряд показательных закономерностей.

Возьмем три двухлисточковые части сложного листа. В первом случае нанесем глицин только на один из двух листочков; во втором на один глицин, на второй - кинетин; в третьем случае - и глицин и кинетин, но только на одну листовую пластинку.

По окраске листьев (на картинке, на самом деле – по распределению радиоактивной метки) можно судить о перераспределении питательных веществ. В первом случае более интенсивно окрашенной будет листовая пластинка, обработанная глицином; во втором наблюдается перетекание веществ из листочка, обработанного глицином,  в обработанный кинетином; в третьем – окрашена только область вокруг точки внесения веществ.

Данный опыт наглядно демонстрирует аттрагирующие свойства гормона.

Цитокинины можно назвать гормонами «молодости» растений (в противоположность этилену). Действительно, с помощью привлечения питательных веществ в определенный орган растения можно замедлить и остановить старение этого органа. Такой эффект можно наблюдать, обрабатывая цитокининами листья деревьев по осени: обработанная листва останется зеленой и не будет опадать.

Этим же объясняется и монокарпия некоторых растений (цветут один раз в жизни). Помимо двулетних, существуют также растения, которые растут не один десяток лет, чтоб потом один раз зацвести и умереть (бамбук, агава). Возможно, при цветении генеративные структуры настолько сильно обедняют цитокининами растение, что оно умирает «от истощения».

  1. Дифференцировка клеток. Цитокинины в основном функционируют в зоне деления корня и, транспортируясь вверх с ксилемным током, накапливаются в апикальной меристеме. При этом происходит контакт цитокининов с камбием, что вызывает пролиферацию его клеток.
  2. Развитие хлоропластов
  3. Снятие апикального доминирования. Нормально функционирующая корневая система должна быть хорошо обеспечена продуктами ассимиляции, что также позволяет нарастить вегетативную массу. Сигналы от корня к побегу, вызывающие рост его частей (в том числе и почек), передаются с помощью цитокининов.
  4. Открытие устьиц происходит в случае поступления из корня богатой цитокининами воды, а их закрытие - если полученные растворы бедны этим гормоном (и обогащены абсцизовой кислотой).
  5. Подавление роста боковых корней. Действительно, если цитокинина много, то главный корень хорошо функционирует, поэтому в образовании боковых корней необходимости нет.
  6. Стимуляция роста бессемянных плодов (партенокарпия). Она тоже связана с аттрагирующим эффектом цитокининов.

Взаимодействие цитокининов и ауксинов

Таким образом, ауксины можно назвать гормонами благополучия побега, влияющими на растяжение клеток, а цитокинины – гормонами благополучия корня, вызывающими пролиферацию клеток. Развитие растения очень сильно зависит не просто от концентраций этих двух гормонов, но от баланса между ними. На примере культуры in vitro (рис.6) можно наблюдать активный ризогенез при смещении равновесия в пользу ауксина, и образование побеговой системы - в случае преобладания цитокинина. Если нет ни одного из гормонов, то деления не происходит, а если в избытке оба, то видно нарастание каллусной массы. Обнаружено, что ауксины активируют циклин-зависимые киназы (CDK), а цитокинины – соответствующие циклины. Комплекс CDK-циклин необходим для клеточного деления.

Взаимодействие гормонов можно наглядно продемонстрировать и на примере целого растения, например, при черенковании. Отделенная веточка представляет собой нормально развитый побег, и, соответственно, там идет синтез ауксина. А вот корней нет, и поэтому там наблюдается явная нехватка цитокининов. Благодаря полярному транспорту ауксины идут по побегу вниз, накапливаются у основания и вызывают ризогенез. Наоборот, если взять корень, богатый цитокининами, у его верхушки происходит накопление гормона, вызывающее пробуждение спящих почек  или образование каллусной массы и геммагенез.

Обратите внимание на положение камбия: он находится между ксилемой, транспортирующей вверх цитокинины, и флоэмой, по которой вниз идут ауксины. Таким образом, камбий получает одновременно оба гормона. При избытке цитокинина происходит преимущественная закладка флоэмы, при избытке ауксинов – ксилемы.

К биосинтезу цитокининов также способны представители бактерий, грибов, насекомых и нематод. Такие особенности были сформированы в ходе длительной коэволюции этих организмов и растений. Так, например, личинки бабочки Stigmella вырабатывают цитокинины, чтобы предотвратить увядание пораженных листьев, которые в итоге остаются зелеными даже во время осеннего листопада.

Фитопатогенные грибы, вырабатывающие ауксин, стимулируют разрастание растительных тканей, что ведет к образованию так называемых «ведьминых метел» - структур, которые образуются в результате аномально частого ветвления веток деревьев.

Многие бактерии, способные к синтезу цитокининов и ауксинов, вызывают опухоли растений. Примером служит знаменитая Agrobacterium tumefaciens - агробактерия корончатых галлов у растений, которая является одним из основных инструментов в биотехнологии благодаря своей способности трансформировать геном растения участками собственных плазмид.

 

Растения представлены самыми разнообразными по внешнему виду, форме и размерам организмами. Это могут быть как миниатюрные особи, вроде мохообразных, так и гиганты размером в 150 метров. Для координированного управления таким гигантским телом необходим постоянный обмен сигналами между различными его частями.

Действительно, как «понять» корню стометрового растения, что где-то наверху развилось большое количество листвы, увеличилась площадь транспирации, и поэтому ему необходимо активно расти, чтобы снабжать организм водными растворами? Каким образом, будучи неподвижным, почувствовать вредителей и избавиться от них?

Для этих и многих других случаев у растений, как и у животных, есть специализированные системы передачи информации: электрическая, действующая локально путем изменения мембранных потенциалов клеток; трофическая, обусловленная потоками различных синтезированных внутри растения (эндогенных) веществ; и самая важная – гормональная, где ключевую роль играют сигнальные молекулы, которые называются фитогормонами. Фитогормоны (дословно с греческого – растительные возбудители) являются низкомолекулярными регуляторными эндогенными веществами, которые способны транспортироваться по растительному организму и вызывать различные тканеспецифичные ответы, но не участвующие во всевозможных метаболических путях непосредственно. Важным свойством всех гормонов является способность действовать в очень небольших концентрациях (примерно 1*10-5 моль/л и меньше).

Действие фитогормонов заключается в изменении программы развития, что выражается комплексным изменением активности клеток и тканей: рост, растяжение, синтез пептидов и всевозможных метаболитов. Любая растительная клетка способна к синтезу всего разнообразия гормонов. Как и гормоны животных, растительные гормоны очень тесно взаимодействуют между собой. Небольшое изменение баланса в гормональной системе серьезно сказывается на различных уровнях организации тела растения.

Гормоны являются первичными мессенджерами в сигнальных путях. Они связываются с рецепторами на клеточной мембране или внутри клетки, и дальше по каскаду вторичных мессенджеров информация передается до конкретной эффекторной системы.

В 1859 году Чарльз Дарвин написал свой известнейший труд «Происхождение видов», давший начало не просто новому этапу развития биологии, но и изменивший мировоззрение миллионов людей. Но не так много людей знает о других работах этого замечательного британского естествоиспытателя. Среди его исследований многие посвящены исследованию физиологии растений. Именно Дарвин в 1857 году в книге «Насекомоядные растения» высказал мнение о том, что растения не только растут и живут, но также обладают чувствами и движениями. Сын Чарльза Дарвина, Фрэнсис Дарвин, вместе с отцом ставил на растениях опыты, которые мы бы сейчас назвали физиологическими.

 Очевидно, что светочувствительность и способность расти по направлению к свету (положительный фототропизм) является очень важной особенностью растений. Опыты по поиску светочувствительной части растений и были поставлены Чарльзом и Фрэнсисом Дарвинами (рис.1)

Деление клеток у растений происходит в особых тканях, называемых меристемами, одной из таких меристем побегов является апикальная (верхушечная) меристема. В некоторой области (субапикальной) под меристемой новообразованные клетки удлиняются и наблюдается рост побега. Было обнаружено, что если освещать проростки с одной стороны, то растения будут поворачиваться к источнику света, при этом изгиб будет формироваться как раз в зоне под меристемой.

В ходе самого опыта проростки канареечной травы освещали с одного бока и в результате наблюдали изгиб верхушки. Изгиб наблюдался и в случае, когда субапикальная зона была закрыта плотным материалом. А вот если закрыть макушки проростков, изгиба наблюдаться не будет. На основе данных эксперимента можно сделать вывод о том, что за световосприятие у растений ответственна меристема, и она, передавая какие-то сигналы нижележащей области, заставляет клетки в ней неравномерно удлиняться, что и обуславливает изгиб.

То, что этот сигнал является химическим веществом, было выявлено в опыте Ф.Вента. Похожие опыты независимо ставили Тиманн и Холодный.

В ходе этого эксперимента у растений отрезали меристему и переносили ее на агар. Из меристемы в агар выделялись разнообразные вещества, в том числе и интересующее исследователя. Затем эти агаровые блоки переносились на побеги с удаленной меристемой. И в том случае, когда использовали агаровый блок с веществами из меристемы, проростки начинали расти. Если же поместить блок только на край побега, то наблюдается изгиб, причем в сторону, противоположную блоку.

Есть несколько путей синтеза ИУК из триптофана (рис.4). В основном пути L-Trp под действием трансаминазы превращается в индол-2-пируват, который после декрабоксилирования и окисления превращается в ИУК. Интересно, что часть ИУК в растениях может иметь бактериальное происхождение. Такое наблюдается в случае заражения бактериями корончатого галла (Agrobacterium tumefaciens). В ходе заражения происходит трансформация растительных клеток плазмидой, несущей гены, отвечающие за неконтролируемый растениями синтез ИУК.


Вызывающее данный эффект химическое вещество, названное ауксином (от латинского слова расти), было выделено Ф.Кёглем из мочи вегетарианцев. Ауксины - это группа разнообразных химических веществ, основное из которых – гетероауксин или β-индолилуксусная кислота (ИУК), синтезируются в основном в апикальной меристеме побега и в растущих листьях, являются гормонами роста в небольших концентрациях, а также ингибиторами роста - в высоких. Последний эффект позволяет использовать синтетические аналоги ауксинов в качестве гербицидов. Применяемыми синтетическими аналогами часто являются 2,4-дифеноксиуксусная кислота, 1-натилуксусная кислота, индолмаслянная кислота. Эти вещества в растении могут превращаться в ИУК.

Инактивация и депонирование избытка гормона происходит путем взаимодействия со специфическими сахарами и белками. Распад идет путем окисления в присутствии молекулярного кислорода.

Для ауксинов, чей дальний транспорт идет по апопласту, существуют специфические трансмембранные переносчики. Протонированная форма активно закачивается в клетку белком AUX1, депротонированная АУК выкачивается из клетки белком PIN. При этом AUX и PIN расположены на разных полюсах клетки, что обеспечивает полярный транспорт гормона. Это особенно важно при развитии и закладке разных частей растения. В присутствии ингибиторов полярного транспорта ауксина наблюдаются аномальные разрастания частей растения и изменение общего габитуса.

Ауксины имеют широкий спектр действия на растения, проявляющийся во множестве физиологических эффектов. Перечислим некоторые из них.

  1. Аттрагирующий эффект. Места синтеза и накопления ауксинов привлекают потоки питательных веществ, необходимых для деления и роста клеток.
  2. Растяжение клеток. Клеточная стенка растений содержит сшивочные гликаны (устаревшее: гемицеллюлоза). Эти полисахаридные молекулы сшивают между собой фибриллы целлюлозы, создавая таким образом жесткий каркас по типу матраса. Внутри клеток тонопласт создает тургорное давление, которое сдерживается жесткой структурой клеточной стенки. Во внеклеточном пространстве содержатся ферменты (экспансины, ксилоглюканэндотрансликозилазы) которые при закислении внеклеточной среды расщепляют связи между сшивочными гликанами, и фибриллы целлюлозы под действием давления расходятся.

Этот процесс вызывается ауксином. ИУК имеет 2 рецептора связывания внутри клетки (рассматриваемые в данном случае). Один (APB-1) находится на внутренней мембранной сети и индуцирует везикулярный транспорт. Второй рецептор внутриядерный и является репрессором промотора гена синтеза протонной помпы. При связывании ИУК с репрессором активируется транскрипция гена помпы, которая далее при трансляции встраивается в мембрану ЭПР и затем транспортируется в везикуле (усиленно за счет APB-1) к плазмалемме и встраивается в нее. Протонная помпа за счет гидролиза АТФ закисляет среду.

С растяжением тесно связаны всевозможные тропизмы растений, кроме гравитропизма, который происходит иначе (рис.6). В корневом чехлике присутствуют статолиты, представленные амилопластами с крахмальными гранулами. С их помощью растение «узнает» о направлении вектора силы тяжести. В соответствии с этим вектором в клетках кончика корня выстраиваются органеллы, а также белки трансмембранного переноса ауксина. Ауксин транспортируется по васкулатуре к кончику корня, где происходит смена направления его транспорта на 180° с помощью различных белков семейства PIN, и транспорт происходит в направлении от корневого чехлика по кортексу. Если корень расположен ортотропно, ауксины распределяются равномерно по всему цилиндру кортекса, и удлинение его клеток в зоне растяжения происходит равномерно. Если корень расположен более-менее горизонтально, то происходит переориентация потока ауксинов преимущественно на нижележащую сторону, где гормон угнетает растяжение, тем самым вызывая изгиб корня по вектору силы тяжести.

Ауксин влияет на дифференцировку клеток в растениях. Потоками ауксина размечаются места закладки прокамбия, т.е. проводящих пучков. Пучок формируется там, где поток ауксинов разворачивается внутрь меристемы.

 Он также отвечает за закладку и развитие ксилемы. Под действием ауксинов происходит вторичное утолщение, пролиферация камбия.Ауксин влияет на дифференцировку клеток в растениях. Потоками ауксина размечаются места закладки прокамбия, т.е. проводящих пучков. Пучок формируется там, где поток ауксинов разворачивается внутрь меристемы.

  1. Ауксины отвечают за эффект апикального доминирования, заключающийся в том, что с потоками гормона боковые почки получают сигнал о благополучии апикальной и не растут. Чем дальше от верхушки, тем слабее сигнал, поэтому почки начинают расти, и наблюдается базитонное ветвление (рис.7Б). При удалении апекса побега (снятии эффекта апикального доминирования) первыми трогаются в рост почки, находящиеся выше всего, т.е. первые, до которых перестал доходить сигнал, это акротонное ветвление (А).

Эффект апикального доминирования также снимается при цветении. Этим можно объяснить существование соцветий типа дихазий.

       5. Будучи ответственны за закладку проводящих пучков в меристеме, ауксины также определяют листорасположение. Согласно одной из гипотез, для закладки проводящего пучка необходимо определенное количество гормона, поступающего из клеток меристемы. Таким образом, существует некая фиксированная площадь, под которой потом будут закладываться проводящие ткани. Ближе, чем позволяют границы этой площади, соседний проводящий пучок не сможет возникнуть. А, поскольку каждый проводящий пучок принадлежит определенному листу, расположение примордиев (зачатков) листа будет соответствовать расположению этой площади. В зависимости от индивидуальных характеристик растения, от размеров его меристемы (количества этих площадей в одном круге) будет зависеть филлотаксис.

       6. Увеличение листовой массы растения вызывает увеличение площади транспирации, что должно сопровождаться более интенсивным поглощением почвенных растворов. Соответственно, ауксины стимулируют ризогенез, заключающийся в закладке боковых и придаточных корней. На этом основано действие сельскохозяйственных препаратов типа Корневина.

  1. Ауксины могут стимулировать развитие плодов без опыления (явление партенокарпии), что используется при получении бессемянных плодов.
Вверх